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猪圆环病毒病2型诊断技术的研究进展

作者:龙冬梅,汤德元等来源: 猪业科学时间:2017-08-11 09:34点击:

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是1974年德国学者Tischer从PK15细胞中发现的一种不产生细胞病变的污染病毒,开始一直未被重视,所以在猪群中广泛传播。直到1982年Tischer等通过实验分离鉴定了该病毒后将其命名为猪圆环病毒,PCV隶属于圆环病毒科、圆环病毒属,基因组为单股单股负链闭合环状DNA病毒。病毒粒子直径为14~25 nm,为二十面体对称结构,无囊膜,是迄今为止发现的一种最小的脊椎动物病毒。根据其致病性、抗原性以及核酸序列的不同,将其分为无致病性的PCV-1型和致病性的PCV2型。两种基因型的基因组序列长度不一样,前者为1 759 bp,后者为1 767 bp或1 768 bp。现在许多国家的猪圆环病毒感染都是PCV2感染。PCV2在临床上主要与断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、仔猪先天性震颤(CT)、坏死性间质性肺炎(PNP)、母猪繁殖障碍等疾病有关。此外,PCV2还侵害机体的免疫系统,增加其他病毒和细菌感染的几率,从而导致猪群的死亡率增加。近年来PMWS在我国猪群中呈流行趋势,造成了很大的经济损失。由于猪群中普遍存在PCV抗体,血清学诊断结果并不准确可靠,所以本病的诊断工作一般都在病猪死亡后进行。同时,PMWS的症状和病变与猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)基本相似,所以仅凭症状、病理变化及流行病学调查很难做出准确的判断。目前,对PCV2的诊断主要是先通过临床症状结合病理变化进行初步判定,再结合实验室检验来确诊。本文将主要对PCV2的实验室诊断方法进行综述,以便为临床上猪圆环病毒病2型的确诊提供依据。现将猪圆环病毒病2型诊断技术综述如下。

1 病原学诊断

1.1 病毒的分离鉴定

采集PMWS病死猪肺、肝、脾、扁桃体及淋巴结等组织研磨制成病料与PBS液体积比为1:5的悬液,在-20 ℃反复冻融3次后12 000 r/min离心20 min,取上清液用220 nm滤器过滤后接种于已长成单层且无PCV污染的PK-15细胞,37 ℃吸附1 h(期间每15 min轻摇一次),然后加入5 mL含2%胎牛血清的MEM/DMEM细胞维持液,37℃培养24 h后倒掉细胞培养液,用300 mmol/L D-氨基葡萄糖处理后用pH为7.4的10 mmol/L无菌PBS洗涤2次,然后加入5 mL含2%胎牛血清的MEM/DMEM细胞维持液,37 ℃培养48~72 h后传代培养,12 h后用300 mmol/L D-氨基葡萄糖溶液处理30 min,弃去D-氨基葡萄糖用pH为7.4的10 mmol/L无菌PBS洗涤2次,然后加入10%胎牛血清的MEM细胞营养液培养,因为PCV2接种细胞后不产生细胞病变(CPE),需连续盲传1-3代后进行PCV2抗原或核酸的检测加以鉴定,也可用免疫荧光技术(IFA)检测病毒的生长情况,或者借助电镜技术和超薄切片法来观察PCV病毒粒子。本方法费时费力,不适于临床上疾病的快速诊断。

在我国,郎洪武等用猪肾传代细胞Dulac株分离到了2株猪圆环病毒。汤德元等将贵州分离到的猪圆环病毒提取的DNA通过PCR技术扩增PCV ORF2基因,克隆到pMD19-T载体并测序,后将构建好的T载体双酶切,然后将回收的目的片段与pET-32a(+)载体及pcDNA3.1(+)载体连接并转化入感受态细胞TOP10中构建原核及真核表达载体,并将ORF2基因插到重组质粒pcDNA3.1-IL-2上,构建以IL-2融合表达真核载体。结果表明:克隆的PCV ORF2基因全长为719 bp,ORF为702 bp,编码233个氨基酸,与GenBank公布的PCV ORF2基因的核苷酸同源性为98.4%。国内很多研究人员分别从各地的病猪上分离到了多株猪圆环病毒。

1.2 电镜观察法

利用电镜技术将感染猪淋巴或病毒细胞培养物制成切片在电镜下观察,则可从平面上观察到病毒的内部结构,形态大小,复制方式等,再结合病毒自身所具有的形态、大小及结构等不同特征即可对观察到的病毒做出准确的判断。

G W Steveson等在透射电镜下观察感染PCV2的PK-15细胞,将细胞病毒液反复冻融3次,8 000 r/min离心30 min后弃沉淀再将上清液40 000 r/min超速离心3 h,弃掉上清液,用0.01 mol/L pH 8.0的TE缓冲液重悬沉淀并收集,通过透射电镜观察到了PCV2,并首次详细描述了细胞的胞浆与细胞核内的病毒包涵体及病毒粒子的形态。

2 血清学检测

2.1 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(ELISA)是将抗原或抗体吸附于固相载体,在载体上进行免疫酶染色,底物显色后用肉眼或酶标仪测定结果的一种方法。这种方法特异性高、敏感性强、检测速度快、可一次检测大批量的样品,既可以检测抗原,又可以检测抗体,是目前应用最多最广也是发展最快的检测方法。

2000年,郎洪武等用加拿大的PCV2克隆化特异性表达抗原、阳性血清、阴性血清,按照常规方法进行PMWS抗体的检测,将被检血清按1:400稀释,阳性和阴性对照血清按1:100稀释,当被检样品的OD值是阳性对照OD值的3倍时判为阳性,否则为阴性,此方法证明ELISA的灵敏度比较高。

2.2 竞争性酶联免疫吸附试验

2000年,Walker等首次利用PCV1和PCV2特异性单克隆抗体建立了竞争ELISA(C-ELISA)方法来检测PCV2抗体。利用细胞培养的PCV2作为抗原,PCV2特异性单克隆抗体作为竞争试剂,成功建立了C-ELISA,将此法与间接免疫荧光方法相比较,结果表明C-ELISA方法的检出率为99.58%,高于间接免疫荧光方法的97.14%,证明此方法与间接免疫荧光相比更加敏感,可用于PCV抗体的大规模监测。

2.3 间接免疫荧光试验

间接免疫荧光技术(IFA)是一种比较特异的血清学方法,主要用于病毒分离效果的鉴定及监测病变组织或猪源细胞PCV的感染情况,其特点是快速、特异、敏感、花费少,既可以检测猪群特异性抗原又可以检测特异性抗原,应用较广泛。

2004年,Racine S等将PCV2 IAF-2897株的ORF2克隆入真核表达载体pCEP5中,并获得了大量的表达,他们用IFA技术对PMWS猪场的44份血清样品进行了检测,结果15份为PCV2阳性,检出率为57.1%。2002年,我国的芦银华等也应用间接荧光技术对几个地区的64份临床血样进行了检测,结果38份血清呈现PCV抗体阳性(59%),这表明PCV已在我国普遍流行。

2.4 抗原捕获ELISA

Mcneilly F等建立了抗原捕获ELISA方法用来诊断PMWS。在与病毒分离、IHC和聚合酶链式反应技术(PCR)等方法的比较中,除PCR外,其他方法均可鉴别PWMS与PCV2的亚临床感染。

周松海将纯化得到的高纯度单克隆抗体包被在96孔酶标板上,0.5% BSA封闭后加入到Cap蛋白中,Cap蛋白与包被的抗体发生特异性反应也结合在酶标板上,可以用来检测血清中的PCV2抗体。对反应条件进行摸索优化,确定包被抗体的最佳稀释度为1∶3 200,与之结合的Cap蛋白最佳稀释度为1∶2 000(即浓为3.52 μg/mL),被检血清最佳稀释度为1∶40,鼠抗猪酶标二抗最佳稀释度为1∶16 000,以此建立的捕获ELISA方法的临界值为0.2,即若血清样品OD630nm值大于0.2则判为阳性,反之则判为阴性。对建立的捕获ELISA方法进行敏感性、特异性和重复性研究,确定此方法具有良好的敏感性、特异性和重复性。

2.5 免疫胶体金技术

免疫胶体金技术(ICGT)的原理是用红色胶体金为标记物,以微孔滤膜为载体,通过渗滤而逐步反应,3~5 min便可完成整个反应。王慧杰等通过克隆和表达猪圆环病毒Cap蛋白基因的羧基端,结合胶体金标记技术,建立了PCV2 Cap抗体胶体金检测方法。用ELISA验证结果显示表达蛋白免疫原性较强且能准确地区分PCV2的阳性血清和标准阴性血清,与猪其他病毒免疫血清无交叉反应,其检测灵敏度与ELISA相似。

2.6 免疫过氧化物酶单层细胞试验

免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法基本原理是将生长有PCV的PK-15细胞在96孔板上长成单层后,加入10倍稀释的待检猪血清,作用一段时间后吸干(或拍干)洗涤,再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的猪IgG抗体,37 ℃孵育30 min,吸干(或拍干)洗涤后加入底物溶液显色,然后终止反应以检测血清中的抗体。黄立平等建立了一种检测PCV-1血清抗体的IPMA方法。利用该方法对257份血清样品进行检测,结果显示,PCV1和PCV2阳性率分别为19.1%和80.5%,且PCV1阳性血清中有95.9%为PCV2阳性,表明临床上PCV1与PCV2在猪群中混合感染程度高。刘长明等将IPMA方法改进后,研制出一种新的IPMA抗体检测试剂盒,适用于猪血清中PCV2抗体检测,且该方法具有特异性强、敏感性高、操作简便等优点。

3 分子生物学诊断技术

分子生物学诊断技术主要应用分子生物学方法检测组织病料或细胞培养物中的病毒核酸,主要包括PCR诊断技术、荧光定量PCR技术 (FQ-PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)、PCR产物限制性片段长度多态性((PCR-RFLP)、原位杂交实验(ISH)、基因芯片检测技术(DNA chip)和核酸杂交检测技术等方法。分子生物学诊断技术具有简单方便、准确性高、特异性强、灵敏度高、检测速度快等优点。

3.1 PCR诊断技术

3.1.1 常规PCR诊断方法

常规PCR检测是一种简便、快速、特异的诊断方法。利用Primer等软件设计一对PCV2特异性引物,可直接从经过处理的病料或细胞中扩增出PCV2特异的基因组片段,以达到特异检测PCV2感染的目的。

汤德元等应用血清学检测和PCR/RT-PCR检测对某规模化猪场病料进行检测,结果发现PCR/RT-PCR结果显示该猪场为PCV2与猪流感病毒(SIV)混合感染。胡玲玲等通过临床症状观察、病理剖检及PCR检测等方法进行诊断,确诊贵州省某规模化猪场母猪产死胎、产后仔猪腹泻、发病仔猪死亡是猪圆环病毒2型感染所引起的。

3.1.2 多重PCR诊断方法

多重PCR(Multiplex PCR)是一种特殊的PCR技术,它可以同时检测2种或2种以上的病毒DNA/RNA,即在同一反应中加入多对引物,可以同时扩增多个目的基因片段。该方法方便、简单、快捷,已广泛应用于疾病的快速诊断。

崔尚金等根据GenBank中20株PCV2核苷酸序列设计两对引物,建立了能同时区分PCV1和PCV2的多重PCR方法,且该方法具有良好的特异性和敏感性。

汤德元等根据GenBank登录的病毒相关基因序列,选择保守区域设计引物,经过反应条件的优化,建立了可同时检测PCV2、伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)三种病毒的检测方法,三种核酸检测的最低浓度为2.2×10-3、2.5×10-2和3.7×10-2ng,证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性。

3.1.3 巢式PCR

巢式PCR(nested PCR)和常规PCR及多重PCR相比更加敏感,当组织病料或细胞中的PCV2模板DNA含量太少时,用这一方法检测比较灵敏。

Kim J等于2001年建立了巢式PCR方法,他们从福尔马林固定的、石蜡包埋的组织中检测到了PCV2病毒,并将该方法同传统的PCR方法和原位荧光杂交做了比较,结果所有37份阳性样品用巢式PCR和原位杂交均能全部检出,而传统的PCR方法只能检出26份,该研究表明:巢式PCR方法和原位杂交均可用于PCV2感染的诊断和检查。

3.1.4 竞争PCR

竞争定量PCR(c-PCR)是预先构建一个具有与靶基因相同的扩增效率和引物结合位点,但探针结合位点内标的不同。在同一个反应管中,靶基因和内标竞争性地与引物结合,进行同步扩增。因为二者是竞争关系,所以当一种模板量逐渐增加时,另一种模板的扩增产物就会相对逐渐减少,但是两种扩增产物的比值和两种初始状态时模板分子数的比值是一致的。所以根据标准品的准确含量制作标准曲线可以进行准确核酸定量。该方法不仅具有PCR方法自身灵敏、特异、快速、简便等优点,还具有简便和定量准确的特点。

崔尚金等应用PCR技术将PCV2 ORF2上490 bp片段P3P4基因扩增后克隆到pMD 18-T载体以获得目标模板。然后构建含692 bp的c-P3P4 DNA片段的竞争模板,其携带与目标DNA和靶DNA相同的引物结合区。以定量的竞争模板同一系列稀释的竞争模板进行竞争PCR扩增,以产物的荧光强度(IOD)绘制标准曲线,结果当反应体系中起始模板的量为1.0×107 cop/μL,循环次数小于或等于30时,原始模板数以指数增长。由此确定目标模板和竞争模板的最适工作浓度并用该方法检测感染细胞内的PCV2基因组的拷贝数和临床样品中的PCV2 DNA含量,结果发现临床样品中的PCV2 DNA含量达到一定程度(肺中1.0145×107 copies/mL,血中0.8×107 copies/mL,淋巴中9.698×108 copies/mL),猪表现临床症状,而病毒在感染细胞内的复制在80 h基因的拷贝数达到最高,这为今后的研究莫定了基础。

3.2 荧光定量PCR技术

荧光定量PCR (FQ-PCR)技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

Brunborg等建立了以TaqMan为基础的实时定量PCR方法,用于血清、血浆及组织样品中的PCV2的定量检测。用该法测定动物中的病毒载量,对鉴别健康猪和带PCV2的病猪十分有用。张福良等采用PCR方法克隆了PCV2 ORF2基因,将构建的重组质粒pMD-ORF2作为PCV2 FQ-PCR检测的标准阳性模板,对该模板进行了酶切及测序鉴定结果显示,此FQ-PCR具有特异性强,稳定性好,准确性和重现性都很高,在-20 ℃条件下保存20 d都没有显著的变化。

3.3 实时定量PCR

实时定量PCR (Real-time PCR)技术是指用SYBR Green荧光染料或荧光探针通过连续监测荧光信号强弱的变化来测定特异性产物的量,以此达到精确定量起始模板数的目的,且不需要取出PCR产物进行分离。该技术可对PCR定量,且和常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高的特点,目前已被广泛地应用于分子生物学检测研究的各个领域。

Mcintosh等利用建立的Real-time PCR方法,在临床血清、肝脏、肾脏、粪便、心肌层、肠系膜淋巴结组织中均能成功检测出PCV2。Brunborg IM等建立了以Taq Man为基础的实时定量PCR方法,用于血清、血浆及组织样品中的PCV2的定量检测。

3.4 PCR产物限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)

这种方法是指在生物进化过程中DNA碱基序列插入、缺失或者改变,从而导致限制性核酸内切酶的识别位点发生改变,是以PCR快速有效的增微量的DNA利用限制性酶进行多态性分析的一种方法。这种方法分2步:首先利用PCV1与PCV2的共同引物进行PCR扩增;然后用一定的限制性内切酶对PCR产物进行酶切,电泳观察片段差异,从而确定PCV的类型为PCV1或PCV2。此方法充分考虑了引物序列在不同毒株间的保守性和酶切位点的特异性,此方法可对不同地区来源的毒株进行检测分型,对不同地区PCV的分子流行病学调查以及PCV2相关疾病的诊断与研究具有重要的意义。

王新等借助RFLP方法对PK-15细胞、IBRS-2细胞以及疑似猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾炎综合征(PDNS)的病料进行了PCV检测以及血清型的鉴定。

3.5 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术(LAMP)基本原理是利用能够识别靶序列上6个特异区域的2-3对引物和一种具有链置换特性的Bst DNA聚合酶,在等温条件(65 ℃左右)下能高效、快速、高特异性地扩增靶序列。

Chen等利用Cap蛋白基因设计6对特异引物建立了PCV2LAMP检测方法,整个反应在64 ℃条件下1 h内完成,其DNA检测极限为5个拷贝;灵敏度是PCR的10倍,且与PCV1,

PPV,PRV及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)无交叉反应。与传统的PCR技术相比,该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便、快速、不需要复杂仪器设备、扩增结果可以凭肉眼便能直接观察等优点,为临床检测PCV2提供了一种快速简便的新方法。

3.6 原位杂交实验(ISH)

根据所用探针的特异性不同,可将ISH方法分为3类,包括同时检测PCV但不能进行分型的ISH;可对PCV1和PCV2进行分型的ISH及检测PCV2与PPV或PRRSV混合感染的ISH。

2002年,Kin J等建立了检测和区分PMWS患猪体内的PCV1和PCV2的双重标记原位杂交技术。他们用地高辛标记的PCV1探针,生物素标记的PCV2探针,检测了经福尔马林固定的、石蜡包埋的组织,经荧光镜下检查,2种杂交信号分别显示红色和暗橙色。同年,Sirinarumitr T等用针对PRRSV的地高辛标记的RNA探针和针对PCV的荧光标记的RNA探针同时进行原位杂交,表明该方法不仅可同时检测2种病毒的感染,而且还可为确定这2种病毒是否共同感染了同一细胞提供了证据。

3.7 基因芯片检测技术

基因芯片(DNA chip)检测技术是指将许多特定的寡聚核苷酸或DNA片段(称为探针)固定在芯片的每个预先设置的区域内,将待测样本标记后和芯片进行杂交,利用碱基互补配对的原理进行杂交,通过检测杂交信号再通过计算机分析来检测对应片段是否存在及存在量的多少,以用于疾病的临床诊断和检测等。是近年来分子生物学与微电子学等多学科交叉融合而成的一项高新技术。

肖驰等根据PCV2、PRRSV和猪瘟病毒(CSFV)的基因序列选取靶标,制备相应的探针并构建DNA芯片,能同时检测出PCV2、PRRSV和CSFV感染。该方法除了特异性强、灵敏度高等优点外,还具有高通量、并行性和结果判读客观、准确和信息化的特点。但该方法目前费用较高,限制了其实际应用。

3.8 核酸杂交检测技术

核酸杂交是指核酸分子单链之间由互补的碱基顺序,通过碱基对之间非共价键形成稳定的杂交双链。姜永厚等应用该技术建立了一种快速检测及鉴定PCV基因型的方法。临床检测结果表明该技术能准确鉴定PCV的基因型,且其灵敏度较凝胶电泳高。因此该技术适用于PCV临床检测及分子流行病学调查。

目前PCV2及相关的疾病已经在全世界范围内广泛发生和流行,给养猪业造成了严重的威胁。引起了国内外学者的广泛关注,国内外学者对PCV2的诊断方法进行了大量的研究,到目前为止,虽然已经建立了多种PCV2的诊断方法,取得了一定的研究进展,但各种诊断方法都有其局限性,因此要根据试验的目的要求,并结合具备的条件选择适宜的检测方法对猪圆环病毒进行检测。所以进一步开展对PCV2诊断方法的研究,实现诊断方法简便性、诊断试剂商品化是十分必要的,以便及时地检测出隐性感染猪和对临床发病猪进行原发性病原的确定,及时对本病进行综合防治,以减少本病所造成的经济损失,从而保障我国养猪业的健康发展。

责任编辑:宋美丽  

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