2017年325个规模猪场7种病毒类疾病病原监测数据分析与2018年防控建议

2017年1～12月份，哈兽维科市场技术服务部检测实验室共收到全国325个规模猪场的1079份病料(肺脏，脾脏和淋巴结等)样品和425份(粪便或肠道组织)样品。采用PCR和RT-PCR等分子生物学方法对7种病毒类疾病病原如猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)等进行检测。通过对检测数据进行整理和统计分析得知，PEDV阳性检出率(174/425)40.94%，PCV2阳性检出率(233/837)27.84%，PRRSV阳性检出率(279/1027)27.17%，PRV阳性检出率(75/899)8.34%，PoRV阳性检出率(20/357)5.60%，CSFV阳性检出率2.29%(21/919)，TGEV阳性检出率(1/386)0.26%。其中PEDV，PCV2，PRRSV，PRV及PoRV等5种病原检出率较高，是危害规模猪场的常见病原。第一、二、四季度保育猪慢性消瘦和呼吸道病严重病例PRRSV，PCV2检出率高，断奶保育期猪群难养，发病率高，死淘率高。第一，二和四季度哺乳仔猪爆发腹泻病例PEDV，PoRV检出率高，造成哺乳仔猪死亡率升高，生长缓慢等。通过临床调查和数据分析得知，进入冬季，气温下降后猪群PEDV发病率显著上升，猪场各生理阶段猪群均有典型腹泻病例，并且发生PEDV猪群很难根治。而PCV2与PRRSV协同感染及与其他病原混合感染，PRRSV毒株多样性是目前疫病防控的难点。总之，2018年我国规模猪场仍要把PEDV，PCV2，PRRSV,PRV，及PoRV等5种病毒类疾病病原作为防控重点，建议猪场加强病原与血清监测，不断提高对疾病的认识和科学使用疫苗，完善生物安全措施，精准用药和避免防疫误区。

1.材料与方法

1.1 样品来源及分布

样品来源于全国24个省市，样品包括肺脏，脾脏和淋巴结等组织以及肠道内容物和粪便，通过调查了解猪场免疫背景和临床发病情况以及剖检典型发病猪取组织样品，-20℃冷冻送检。

图1 样品分布(红色圆圈代表样品来源区域)

1.2 主要试剂和仪器

PCR和RT-PCR 扩增试剂盒、饱和酚、TaqDNA聚合酶、dNTPs、EB、DEP水、TRIZOL(总RNA抽提试剂，主要成分苯酚等)、DL2000 Marker、TaKaRaRNA PCRKit(AMV)Ver.3.0均购自宝生物工程(大连)有限公司。生物安全柜、分析天平、高速离心机、迷你掌上离心机、涡旋振荡器、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪、冰箱、微波炉、水浴锅、高压蒸汽灭菌锅等。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank 登陆的PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、PEDV、TGEV、PoRV的基因序列，用 Oligo6.0 软件设计引物，由宝生物工程(大连)有限公司合成。引物序列见表1。

表1 用于PCR和RT-PCR反应的引物

1.4 样品处理及核酸提取

按检测需求分别对取肺脏、脾脏、淋巴结样品混合，对肠内容物和粪便混合用研磨器充分研磨，利用MEM营养液进行10倍稀释，然后利用DNA和RNA提取试剂盒进行核酸抽提。

1.5 病毒核酸检测

1.5.1 PRRSV、CSFV、PEDV、TGEV、PoRV的扩增 分别用BIOZOL总RNA提取试剂盒(博日公司)从病毒培养液提取总RNA为模板，采用TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)试剂盒进行RT-PCR扩增，反应条件RT: 50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min;PCR：(94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃1 min)×35个循环，72 ℃延伸7 min，PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.5.2 PRV、PCV2的扩增

分别用天根生物科技有限公司DNA提取试剂盒，从病毒培养液提取DNA为模板，采用TaKaRa One Step DNA PCR Kit试剂盒进行PCR扩增，反应条件94℃ 2 min;(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)×35个循环，72 ℃延伸10 min，PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2 结果与分析

2.1 PCR或RT-PCR扩增结果

2.1.1 2017年对24个省325个规模猪场送检1079份肺脏、脾脏和淋巴结等组织样品与425份肠道内容物，粪便等样品，分别进行了PEDV、PCV2、PRRSV、PRV、CSFV、TGEV、PoRV等7种病原的检测。结果显示，PEDV阳性检出率(174/425)40.94%，PCV2阳性检出率(233/837)27.84%，PRRSV阳性检出率(279/1027)27.17%，PRV阳性检出率(75/899)8.34%，PoRV阳性检出率(20/357)5.60%，CSFV阳性检出率2.29%(21/919)，TGEV阳性检出率(1/386)0.26%，7种病原中PEDV、PCV2、PRRSV，PRV等4种病原检出率明显高于其他3种病原，其中TGEV检出率最低。(如图2)。

图2.2017年全年各常见病毒检出率统计

2.1.2 2017年送检样品中PEDV在第一、二、三、四季度的检出率分别为48.48%、%、61.22%、14.43%，39.69%，其中第一，第二，第四季度是PEDV高发期，第三季度PEDV检出率最低。PCV2在第一、二、三、四季度检出率分别为26.74%、27.98%，28.05%、28.27%。PCV2的检出率四个季度均较高，其危害基本不受季节影响。PRRSV在第一、二、三、四季度检出率分别为25.88%、27.65%、25%、29.12%。PRRSV的检出率在四个季度均有较高检出率，第四季度检出率高于其他三个季度。PRV在第一、二、三、四季度的检出率分别为5.44%、8.33%、6.48%、11.54%。相对与前三季度，第四季度PRV的检出率较高，从数据统计看第四季度和第一季度，秋冬春季节环境冷应激会影响猪群体质，4个病原检出率相对较高(如图3)。

图3.不同季度PEDV、PCV2、PRRSV、PRV四种病毒检出率动态变化

　　2.1.3 对233份PCV2抗原阳性样品统计PCV2单独感染和PCV2与PRRSV、PRV、PEDV等混合感染情况。其中PCV2单独感染检出率最高(48.50%),PCV2与PRRSV混合感染检出率37.34%，PCV2与PRV混合感染检出率为6.44%(如图4)。

图4.2017年1-12月PCV2与其他病毒混合感染变化

2.1.4 对279份检测到PRRSV阳性样品统计PRRSV单独感染和PRRSV与PCV2、PRV、PEDV等病原混合感染情况。PRRSV与PCV2混合感染检出率为31.18%，PRRSV单独感染检出率为54.48%。(如图5)。

图5.2017年PRRSV与其他病毒混合感染变化

2.1.5 比较2016年与2017年7种病原检出率的变化显示，CSFV检出率由2016年1.45%上升至2017年的2.29%。PRRSV检出率由2016年24.96%上升至2017年的27.17%。PCV2检出率由2016年的35.90%下降为27.84%。PRV的检出率由2016年的16.86%下降为8.34%。PEDV检出率由40.98%下降到40.94%。TGEV检出率由2016年同期的3.05%下降到0.26%。PoRV检出率由2016年同期4.84%上升到5.60%。(如图6)

图6.2016年与2017年7种病原阳性检出率对比变化

3 讨论

3.1.1 2017年通过325个规模猪场的1079份(肺脏，脾脏和淋巴结等)样品和425份(粪便或肠道)样品。采用PCR和RT-PCR方法对常见7种病毒类疾病病原检测和数据统计分析得知，PEDV阳性检出率(174/425)40.94%，PCV2阳性检出率(233/837)27.84%，PRRSV阳性检出率(279/1027)27.17%，PRV阳性检出率(75/899)8.34%，PoRV阳性检出率(20/357)5.60%，CSFV阳性检出率2.29%(21/919)，TGEV阳性检出率(1/386)0.26%，7种病原中PEDV、PCV2、PRRSV，PRV等4种病原检出率明显高于其他3种，其中TGEV检出率最低。PEDV、PCV2、PRRSV、PRV及PoRV等5种病原仍是危害规模猪场的常见病原。CSFV，TGEV等2种病原检出率较低，说明猪场控制的较好。

3.1.2 通过对猪场背景调查和检测数据分析得知，第一、二、第四季度断奶保育期间慢性消瘦和呼吸道病严重病例送检PRRSV和PCV2检出率相对较高，PRRSV和PCV2病原阳性场断奶到生长期猪群难养，均匀度差，死淘率高;第一季度，第二季度和第四季度哺乳仔猪爆发腹泻病例PEDV检出率高，造成哺乳仔猪和断奶仔猪严重腹泻，死亡率高，生长缓慢等。可见秋季，冬季和春季三个季节因气温下降和昼夜温差大等环境因素导致猪体抗病能力下降容易感染PEDV、PRRSV、PCV2、PoRV等病原。所以，气温下降前加强猪场保温设备投入和强化免疫评估等措施应对疾病威胁。

3.1.3 统计7种病原混合感染情况得知，PRRSV与PCV2的共感染现象最为严重,另外PCV2、PRRSV单独感染的情况也比较普遍，PCV2、PRRSV与PRV的混合感染也占有一定的比例，PEDV与PRRSV，PRV，PCV2的混合感染病例要引起重视。建议猪场科学合理安排PCV2、PRRSV、PRV等病原的疫苗免疫注射工作和生物安全措施，引种要慎重。

3.1.3 比较2015年与2016年7种病原CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、PEDV、TGEV、PoRV阳性检出率，其中PRRSV、CSFV、PoRV等3种病原检出率升高，而PCV2、PEDV、PRV、TGEV、PoRV等5种病原检出率略有下降。

3.1.4 对检测PRRSV的样品，要求描述临床症状并剖检取肺脏病变部位、脾脏和淋巴结混合作为检验样品，采用RT-PCR方法，不同引物检测能区分经典株、变异株和类NADC30株，但做数据统计时不同毒株的阳性样品均判定PRRSV阳性。从送检单位反映的信息和实验室的检测结果分析得知PRRSV的不同毒株在临床上均有致病性，生长猪感染后会表现不同程度的发烧、咳喘、消瘦、生长抑制、精神沉郁，剖检以肺脏病变为主，部分样品来自早产和正常分娩所产死胎。PRRSV导致的母猪繁殖障碍与断奶后生长猪的呼吸道病仍是临床常见的表现形式。检测PRV的样品主要以发病猪脑为主，临床上表现典型神经症状，如肌肉震颤，精神沉郁，口吐白沫等哺乳仔猪和保育猪发病为主。部分猪场爆发时以母猪流产，早产，死胎等，保育猪神经症状和育成猪严重呼吸道病为典型临床表现。剖检后脑出血病变严重。选用合适的引物，通过PCR方法检测特异性好，敏感度高。检测PCV2的样品主要为淋巴结和脾脏等免疫器官为主。因PCV2感染猪体免疫器官造成白细胞水平下降，机体免疫机能下降，在临床上表现断奶后仔猪至生长猪阶段慢性消瘦、生长抑制以及与PRRSV等病毒和细菌感染增加此阶段猪死淘率。临床PCV2疫苗应用广泛，但因疫苗品质和免疫方法不正确导致免疫效果不理想，临床样品检出率较高。检测PEDV、TGEV、PoRV等病毒的样品只要来自腹泻猪的粪便和小肠内容物，采用RT-PCR方法检测特异，敏感，方法可靠，也可以采取胶体金的方法检测。PEDV感染发病急，传播快，哺乳仔猪死亡率为典型特征。通过检测发现PEDV流行已经无明显季节性特征，并且临床上感染各生理阶段猪群。所以，猪场要加强群体免疫和全年免疫的理念，做好保温，消毒及营养等措施能降低发病率和发病死亡率。

4 免疫建议(仅供参考)

1 猪繁殖与呼吸综合征疫苗

①阴性猪场，种公猪/母猪一年普免3-4次(产前40天至分娩慎重免疫)，或者配种前免疫1次，4毫升/头，妊娠60天前加强免疫1次，4毫升/头，猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗4毫升/头，仔猪28-35天免疫2毫升/头。

②阳性稳定猪场，种公猪/母猪一年普免3次(产前40天至分娩慎重免疫)，2头份/头，仔猪21-35日龄免疫1头份/头，后备猪配种前免疫1次，2头份/头，猪繁殖与呼吸综合征弱毒活疫苗(CH-1R株)。

③阳性稳定活跃场，种母猪一年普免3次(产前40天至分娩慎重免疫)，2头份/头，仔猪3周后免疫2头份/头，后备猪配种前免疫1次，2头份/头，推荐猪繁殖与呼吸综合征弱毒活疫苗(CH-1R株)。种公猪免疫猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗4毫升/头。

④阳性不稳定猪场，种母猪配种前免疫(产后10-14天)2头份/头，仔猪免疫1头份/头(发病前3-4周免疫疫苗)，推荐猪繁殖与呼吸综合征弱毒活疫苗(CH-1R株)或高致病蓝耳病活疫苗(HuN4F112株)。种公猪免疫猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗。

⑤爆发猪场，检测结果为PRRSSV类NADC30株，建议对未发病健康生长猪，紧急免疫猪高致病蓝耳病活疫苗(HuN4F112株)2头份/头，仔猪断奶前后免疫0.5-1头份/头，妊娠前，中期母猪补免1头份/头，待猪群稳定后，母猪配种前免疫1次(产后10-14天)，2头份/头，仔猪3周龄前后(21-35天)免疫1头份/头。有高致病蓝耳病弱毒疫苗免疫背景，猪群发病后检测结果为PRRSV变异株，建议对未发病健康生长猪紧急免疫猪蓝耳病活疫苗(CH-1R株)2头份/头，仔猪断奶前后免疫1头份/头，妊娠前，中期母猪补免2头份/头，待猪群稳定后，母猪配种前免疫1次(产后10-14天)，2头份/头，仔猪3周龄前后(21-35天)免疫1头份/头。建议种公猪免疫猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗4毫升/头，间隔3周加强免疫;经过1-2年，种公/母猪均免疫猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗4毫升/头。

2 猪瘟兔化弱毒疫苗

种公猪/种母猪一年普免3-4次，2头份/头或母猪产后21天跟胎免疫2头份/头，仔猪28-35日龄首免2头份，56-63日龄二免2头份;后备猪配种前免疫1次，2头份/头。

3 猪伪狂犬病活疫苗

种公猪/母猪一年普免3-4次，2头份/头，仔猪1-3日龄滴鼻1头份/头(PRV-gE抗体阴性的猪场可不滴鼻)，45-55日龄二免2头份/头，90-100日龄三免2头份/头。

4 猪圆环病毒2型灭活疫苗

种公猪/母猪一年普免3-4次(产前15天至分娩慎重免疫)，2毫升/头，或者母猪产前30天，产后14天加强免疫2毫升/头，仔猪7-14日龄首免1毫升，28-35日龄二免1毫升，断奶仔猪和保育中后期出现典型断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)问题应在发病前2-3周建立坚强免疫。

5 猪流行性腹泻和轮状病毒疫苗

种公猪/母猪分娩前40-50天妊娠母猪免疫1头份/头，产前20-30天加强免疫1头份/头(建议常年跟胎次免疫);分娩前10-15天免疫PED灭活疫苗2-4毫升/头，仔猪断奶时免疫1头份/头，后备猪配种前免疫2次/，1头份/头，间隔21天加强免疫。针对母猪分娩前后血清PED-IgG抗体监测和初乳IgA的抗体监测结果决定如何进行开展针对PED科学免疫意义较大。

责任编辑：程少霞